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如何使用實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應檢測新冠病毒?

Nicole Jawerth

隨著引起新冠疾病的冠狀病毒在全球范圍內(nèi)傳播,原子能機構與聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(糧農(nóng)組織)合作,提供支持和專門知識,幫助各國使用實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應,這是檢測、跟蹤和研究新冠病毒的最快、最準確的實驗室方法之一。

但什么是實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應?它是如何工作的?它與聚合酶鏈反應有什么不同?此外,它和核技術有什么關系呢?本文對該技術及其工作原理以及一些有關病毒和遺傳學的新知識做一個簡單的概述。

什么是實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應?

實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應是一種核衍生方法,用于檢測包括病毒在內(nèi)的任何病原體中特定遺傳物質(zhì)的存在情況。最初,該方法使用放射性同位素標記檢測目標遺傳物質(zhì),但隨后的改進導致同位素標記被特殊標記物(最常見的是熒光染料)取代。這項技術使科學家?guī)缀蹩梢栽谶^程仍在進行時立即看到結(jié)果;而常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應只能在過程結(jié)束時提供結(jié)果。

實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應是檢測新冠肺炎病毒最廣泛使用的實驗室方法之一。雖然許多國家已經(jīng)將實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應用于診斷埃博拉病毒和寨卡病毒等其他疾病,但許多國家在將這種方法用于新冠肺炎病毒和提高國家檢測能力方面需要支持。

什么是病毒?什么是遺傳物質(zhì)?

病毒是由分子包膜包圍的遺傳物質(zhì)微觀包。這種遺傳物質(zhì)可以是脫氧核糖核酸,也可以是核糖核酸。

脫氧核糖核酸是一種存在于所有生物體(如動物、植物和病毒)中的雙鏈分子,它掌握著這些生物體如何形成和發(fā)展的遺傳密碼或藍圖。

核糖核酸通常是一種單鏈分子,它復制、轉(zhuǎn)錄并傳遞部分遺傳密碼給蛋白質(zhì),使蛋白質(zhì)能夠合成并執(zhí)行維持生物體存活和發(fā)育的功能。核糖核酸的不同變體負責復制、轉(zhuǎn)錄和傳遞。

一些病毒,如引起新冠肺炎的SARS-CoV-2冠狀病毒,只含有核糖核酸,這意味著它們依靠滲透到健康細胞中來繁殖和存活。一旦進入細胞,這種病毒就會利用自己的遺傳密碼(就新冠肺炎病毒而言是核糖核酸)控制并“重新編程”細胞,將其變成病毒制造工廠。

為了使像新冠肺炎病毒這樣的病毒能夠在體內(nèi)早期被利用實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應檢測到,科學家們需要將核糖核酸轉(zhuǎn)化為脫氧核糖核酸。這是一個被稱為“逆轉(zhuǎn)錄”的過程。他們這樣做是因為只有脫氧核糖核酸可以被復制或擴增,這是實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應檢測病毒過程的一個關鍵部分。

實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應是如何對新冠肺炎病毒進行檢測的?

從新冠肺炎病毒聚集的身體部位如人的鼻子或喉嚨采集樣本。用幾種化學溶液處理樣本,去除蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì),只提取樣本中存在的核糖核酸。提取的核糖核酸是人自身的遺傳物質(zhì)和病毒的核糖核酸(如果存在)的混合體。

這種核糖核酸被利用一種特定的酶逆轉(zhuǎn)錄成脫氧核糖核酸。然后,科學家再添加與轉(zhuǎn)錄的病毒脫氧核糖核酸的特定部分互補的脫氧核糖核酸短片段。如果樣本中存在病毒,這些片段就會附著在病毒脫氧核糖核酸的靶區(qū)。一些添加的遺傳片段在擴增過程中用于構建脫氧核糖核酸鏈,而其他的遺傳片段則用于構建脫氧核糖核酸并在鏈上添加標記標簽,然后用于檢測病毒。

隨后,這種混合物被放入逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應機器中。該機器在加熱和冷卻混合物的溫度中循環(huán),從而引發(fā)特定的化學反應,產(chǎn)生新的、相同的病毒脫氧核糖核酸靶區(qū)拷貝。這個循環(huán)一遍又一遍地重復,繼續(xù)復制病毒脫氧核糖核酸的靶區(qū)。每循環(huán)一次都使先前的數(shù)量倍增:兩份拷貝變成四份,四份變成八份,以此類推。一個標準的實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應裝置通常要經(jīng)過35次循環(huán),這意味著在這個過程結(jié)束時,從樣本中存在的每一條病毒鏈中產(chǎn)生大約350億個新的病毒脫氧核糖核酸靶區(qū)拷貝。

當病毒脫氧核糖核酸靶區(qū)的新拷貝被構建時,標記標簽會附著在脫氧核糖核酸鏈上,然后釋放出熒光染料,由機器的計算機測量并實時顯示在屏幕上。計算機跟蹤樣本中每次循環(huán)后的熒光量。當熒光量超過某一熒光水平時,就證實病毒存在。科學家們還監(jiān)測需要多少次循環(huán)才能達到這個水平,以估計感染的嚴重程度:循環(huán)越少,病毒感染越嚴重。

為什么要用實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應方法?

實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應技術具有高度的敏感性和特異性,可以在短短的三小時內(nèi)提供可靠的診斷,而通常實驗室平均需要六到八小時。與其他可用的病毒分離方法相比,實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應的速度明顯較快,并且由于整個過程可以在封閉的試管內(nèi)完成,因此污染或出錯的可能性更低。它仍然是可用的檢測新冠肺炎病毒的最準確方法。

然而,實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應不能用于檢測過去的感染,盡管這對了解病毒的發(fā)展和傳播很重要,因為病毒僅在特定的時間窗口內(nèi)存在于體內(nèi)。要檢測、跟蹤和研究過去的感染,特別是那些可能在沒有癥狀的情況下發(fā)展和傳播的感染,必須采用其他方法。

什么是聚合酶鏈反應,它與實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應有什么不同?

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應是聚合酶鏈反應的一種變體。這兩種技術使用相同的過程,只是逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應增加了核糖核酸到脫氧核糖核酸的逆轉(zhuǎn)錄步驟,以進行擴增。這意味著聚合酶鏈反應用于病毒和細菌等已經(jīng)含有脫氧核糖核酸的病原體進行擴增,而逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應用于含有核糖核酸但需要轉(zhuǎn)錄為脫氧核糖核酸的病原體進行擴增。這兩種技術都可以“實時”進行,意味著結(jié)果幾乎可以立即看到,而“常規(guī)”使用時,結(jié)果只能在反應結(jié)束后才能看到。

聚合酶鏈反應是用于檢測引起埃博拉、非洲豬瘟和口蹄疫等疾病的病原體(包括病毒)的最廣泛使用的診斷檢測方法之一。由于新冠肺炎病毒只含有核糖核酸,所以采用實時或常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應進行檢測。

20多年來,原子能機構與糧農(nóng)組織合作,特別是通過其獸醫(yī)診斷實驗室網(wǎng),為來自世界各地的專家使用實時逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應方法提供了培訓和設備。最近,該技術還被用于診斷其他疾病,如埃博拉、寨卡、中東呼吸綜合征和嚴重急性呼吸綜合征,以及其它主要動物疾病。它還被用來檢測主要的人畜共患疾病,即也可以感染人類的動物疾病。

2020.06
Vol. 61-2

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